接触式超声在胞内蛋白及核酸提取过程中的应用

背景

　　脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，又称内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，可作用于膜受体激活多种细胞(巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等)信号转导系统，促进促炎细胞因子和其他炎性介质的合成及释放，引发炎症反应。客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚(Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs)的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。

材料与方法

1.1羊栖菜多酚的制备

　　取干燥羊栖菜粉末，加入体积分数60%乙醇溶液，使用SCIENTZ-IID 超声辅助浸提(料液比1:20(m/V)、50℃、60min)，抽滤后真空减压蒸馏去除乙醇，获羊栖菜粗多酚溶液，依次采用等体积石油醚、乙酸乙酯分级萃取，真空减压蒸馏后冻干(使用 SCIENTZ-12N 过夜冻干)，获得HFPs粉末。测得HFPs粉末总酚含量为23.67±0.24 mg/g。利用无菌水配制成多酚母液，再以细胞培养液稀释至不同浓度，用于后续实验。

1.2炎症细胞培养

　　使用完全培养基(含10%(体积分数，下同)胎牛血清和1%青链霉素双抗DMEM培养基)培养RAW264.7细胞，37℃、5% CO2培养，细胞融合度约80%时进行传代。然后分成3组进行培养:①阴性对照组，仅加入含10%胎牛血清的DMEM培养基;②LPS阳性对照组，加入含LPS (1μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24 h;③HFPs+LPS组，经含不同质量浓度(10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350μg/mL)HFPs和10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，以含LPS(1μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24h。

1.3RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定

　　1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞2次，每孔加入500μL TRIzol试剂，使用SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取总RNA，超声参数为:100W，1s开1s关，共1min，并将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green嵌合荧光法与引物进行实时荧光定量PCR。测定目的基因(IL-1β、IL-6、TNF-a、COX-2、iNOS)和内参基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1)Ct值，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.4MAPKs、NF-KB信号通路关键蛋白相对表达量测定

　　1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞2次，加入200μL RIPA细胞裂解液，使用SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取蛋白质，超声参数为:100W，1s开1s关，共1min，离心(12000r/min、4℃)10min取上清液。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，用蛋白上样缓冲液调整蛋白质量浓度为2mg/mL，95℃加热10min使蛋白变性然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离;湿转到聚偏二氟乙烯膜;5%(质量分数)脱脂奶粉(TBST溶液配制)封闭1h;一抗4℃孵育12h;二抗室温孵育2h;加入ECL试剂进行显色反应，测定蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相应蛋白磷酸化水平。

结果与分析

01RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定结果

　　采用实时荧光定量PCR测定HFPs对LPS诱导的巨噬细胞中重要促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-a基因相对表达量，以及炎症相关酶COX-2基因相对表达量的影响。如图1所示，LPS刺激不同时间后，所有炎症介质的mRNA表达水平均显著提高(P<0.05)。HFPs对促炎细胞因子的抑制作用与其剂量、LPS诱导时间及细胞因子种类相关。与LPS组相比，静息状态细胞经HFPs处理再经LPS诱导12、24h后，IL-1β和IL-6的基因相对表达量显著下降;HFPs显著抑制LPS诱导3h后TNF-a基因的相对表达，而在LPS诱导6~24h的抑制作用总体不明显。在LPS诱导24h，较低剂量HFPs(30、60μg/mL) 预处理对COX-2基因表达具有显著抑制作用，但提高剂量后该抑制效果消失，甚至出现反向促进作用，120μg/mL HFPs预处理促使COX-2相对表达量较LPS组显著上升(P<0.05).

02MAPKs、NF-KB信号通路关键蛋白相对表达量测定

　　1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞2次，加入200μL RIPA 细胞裂解液，使用SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取蛋白质，超声参数为:100W，1s开1s关，共1min，离心(12000r/min、4℃)10min取上清液。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，用蛋白上样缓冲液调整蛋白质量浓度为2mg/mL，95℃加热10min使蛋白变性然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离;湿转到聚偏二氟乙烯膜;5%(质量分数)脱脂奶粉(TBST溶液配制)封闭1h;一抗4 ℃孵育12h;二抗室温孵育2h;加入ECL试剂进行显色反应，测定蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相应蛋白磷酸化水平。

总结

　　客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚(Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs)的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。超声波细胞粉碎机在整个实验中起到作用如下:

　　01辅助提取羊栖菜中多酚组分，加速多酚组分释放，缩短了提取进程，后续通过冻干步骤即可获得羊栖菜多酚粉末，溶解后备用;

　　02搭配TRIzol试剂对细胞中总RNA进行提取，试剂中含有苯酚，可加速细胞破碎和核酸释放，还加入核酸酶抑制物质防止RNA降解，PCR结果表明提取的RNA浓度与纯度较好，可用于相关基因表达情况的分析;

　　03搭配RIPA裂解液对细胞中的蛋白质进行提取，大幅减少原本冰上裂解所需时间(30 min)，试剂中含有的蛋白酶抑制剂可防止蛋白降解，还含有磷酸酶抑制剂，防止蛋白提取后的再修饰，更好测定蛋白磷酸化状态。